ZEISS Lightsheet 7

Ihr Lichtblattmikroskop für das Multiview-Imaging lebender und geklärter Proben

Die biowissenschaftliche Forschung stellt hohe Anforderungen an Ihre Bildgebungskapazitäten: Nicht selten müssen lebende Modellorganismen als Ganzes abgebildet sowie Gewebe und Zellen während ihrer Entwicklung dargestellt werden. Mit ihrem einzigartigen Beleuchtungsprinzip ermöglicht die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM, Light Sheet Fluorescence Microscopy) das schnelle und schonende Abbilden dieser Proben. Die besonders hohe Stabilität von Lightsheet 7 sorgt dafür, dass lebende Proben über längere Zeiträume – sogar über Tage – mit weniger Phototoxizität als je zuvor beobachtet werden können. Darüber hinaus lassen sich mit diesem Lichtblattmikroskop sehr große optisch geklärte Proben sowohl als Ganzes als auch in subzellulärer Auflösung abbilden. Die speziellen Optiken, Probenkammern und Probenhalter von Lightsheet 7 können auf den Brechungsindex der gewählten Clearing-Methode eingestellt werden, um große Proben, beispielsweise ganze Mausgehirne, zu betrachten. Mehr Flexibilität, als mit dem stabilen geschlossenen Lichtblattmikroskop von ZEISS, werden Sie kaum woanders finden.

Highlights

Abbildung optisch geklärter Proben

Die Auswahl einer geeigneten Clearing-Methode hängt von verschiedenen Faktoren ab: von der Art des Gewebes, der verwendeten Fluoreszenzmarker und der Größe der Probe. Lightsheet 7 passt sich an alle Bedingungen an. Sie können jetzt Proben von bis zu zwei Zentimetern in nahezu allen Clearing-Lösungen mit einem Brechungsindex von 1,33 bis 1,58 abbilden. Das stabile Lichtblattmikroskop erstellt direkt Übersichtsbilder und Daten in subzellulärer Auflösung. Für optisch geklärte Organoide, Sphäroide, Organe, Gehirne oder andere Proben gilt: Lightsheet 7 ist das Mikroskop der Wahl für die schnelle und schonende LSFM-Bildgebung.

^{C57/BL6J-Maus, perfundiert mit PBS, CellTracker™ CM-DiI-Farbstoff und 4 % PFA. Nach dem iDISCO+-Protokoll geklärt, Zimtsäureethylester als letzte RIMS.}

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von Erin Diel – Harvard University; Harvard Center for Biological Imaging Room 2052, 16 Divinity Ave, Cambridge, MA 02138, USA}

Mit freundlicher Genehmigung schließen

Beste Bildqualität und Stabilität

Das einfach zu bedienende Lightsheet 7 hebt Ihre LSFM-Bildgebung auf ein neues Niveau. So erzielen Sie die bestmögliche Bildqualität in einem breiten Anwendungsspektrum.
Neu entwickelte Optiken und Probenkammern sorgen für die optimale Anpassung an den Brechungsindex. Der neue Probenhalter vereinfacht das Befestigen größerer Proben. Intelligente Softwaretools helfen die Abbildungsparameter zu definieren, u. a. Lichtblatt- und Probenpositionen, korrekte Zoomeinstellungen, Tiles & Positions sowie Datenverarbeitungsparameter. Alle neuen Funktionen gehen Hand in Hand mit der zuverlässigen Kombination von Laserscanning und Zylinderlinsen von ZEISS, um die Lichtblattbeleuchtung zu erzeugen. Die patentierte Pivot-Scan-Technologie liefert artefaktfreie optische Schnitte in bester Bildqualität.

Spezielle Optiken für Ihr ZEISS Lightsheet 7

Schnell und schonend echtes Leben betrachten

Lightsheet 7 bietet mit den hocheffizienten sCMOS-Detektoren (pco.edge) die Möglichkeit, schnellste Prozesse bei geringer Beleuchtungsintensität zu erfassen. So können Sie Vorgänge in Ihren lebenden Proben direkt beobachten, ohne dass Anregungslicht negative Auswirkungen auf die Ergebnisse hat. Für vertikal ausgerichtete Proben und höchste Bildraten kann der CMOS-Detektor ZEISS Axiocam 702 verwendet werden. Die spezielle Probenkammer kann gewärmt, gekühlt oder mit CO2 angereichert werden und bietet so die optimale Umgebung für Experimente mit lebenden Zellen. Hinzu kommen Multiview- und Triggeroptionen, um externe Geräte zu steuern. Damit ist Lightsheet 7 das ideale Lichtblattmikroskop zur Beobachtung von laufenden Prozessen in einer nahezu unbegrenzten Bandbreite von Organismen.

Entwicklung einer Arabidopis-Blüte – Probe mit freundlicher Genehmigung von S. Valuchova, P. Mikulkova und K. Riha, Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk-Universität, Brno, Tschechische Republik.

Das Prinzip der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) teilt die Fluoreszenzanregung und -detektion in zwei separate Lichtwege, wobei die Beleuchtungsachse senkrecht auf der Detektionsachse steht. Das bedeutet, dass jeweils nur ein einzelner, dünner Bereich der Probe beleuchtet wird. Dabei entsteht ein inhärenter optischer Schnitt, weil nur die Fluoreszenz der Fokusebene angeregt wird. Lochblenden und Bildbearbeitung sind nicht erforderlich. Das Licht aus der Fokusebene wird auf den Pixeln einer Kamera gesammelt und nicht Pixel für Pixel ausgelesen wie mit Konfokal- oder anderen Laser-Scanning-Mikroskopen. Die Parallelisierung der Bilderfassung auf einem kamerabasierten Detektor ermöglicht schnellere Bildraten mit weniger Anregungslicht als bei vielen anderen Mikroskopietechniken. Zusammenfassend verbindet LSFM das optische Schnittverfahren mit paralleler Bilderfassung der gesamten Brennebene. Das macht 3-D-Imaging extrem schnell und überaus lichteffizient.

Die Entkopplung der Detektionsoptiken von den Beleuchtungsoptiken ermöglicht die Fluoreszenzanregung mithilfe spezieller Linsen mit niedriger numerischer Apertur, und das ohne Einbußen bei der Detektionsauflösung und -empfindlichkeit. Damit ist die LSFM ideal für die Abbildung von Proben im Millimeterbereich, beispielsweise sich fortlaufend entwickelnder Organismen oder großen geklärten Gewebeproben.

Funktionsweise des Lightsheet 7

Sehen Sie in der Animation, wie einfach Ihre Proben mit ZEISS Lightsheet 7 positioniert und abgebildet werden können.

Der patentierte Pivot-Scanner

für homogene Ausleuchtung

Wenn das Lichtblatt die Probe durchdringt, absorbieren oder streuen einige Strukturen der Probe, z. B. Zellkerne, das Anregungslicht. Dabei werden entlang der Beleuchtungsachse Schatten geworfen (Abbildung links). Dieser Effekt tritt bei allen Fluoreszenzmikroskopen auf, doch bei der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie steht die Beleuchtungsachse senkrecht auf der Detektionsachse, sodass dieser Effekt deutlicher wird. Beim Lightsheet 7 verändert ein patentierter Pivot-Scanner den Winkel des Lichtblatts während der Bildaufnahme nach oben und unten. Dadurch fallen die Schatten in unterschiedliche Richtungen und das Anregungslicht erreicht auch Bereiche hinter opaken Strukturen (Abbildung rechts). Dieser patentierte Pivot-Scanner trägt auf ideale Weise dazu bei, artefaktfreie Bilder aufzunehmen und die späteren Verarbeitungs- und Analyseschritte zu optimieren. Es ist immer besser, potentielle Artefakte direkt an ihrem Ursprung zu beseitigen.

ZEISS Lightsheet 7 im Einsatz

Nephrologie

Mausniere, nach dem iDISCO-Protokoll geklärt und in Zimtsäureethylester mit der ZEISS Lightsheet 7-Detektionsoptik 5×/0,16 foc. und Clr 20×/1,0 nd. = 1,53 abgebildet (Ausschnitt). Zur Darstellung der Vaskulatur und der Glomeruli (rot) wurde die Maus mit DyLight-594-konjugiertem Tomato Lektin eingefärbt. Grün: Autofluoreszenz zur Abbildung der Gewebeanatomie. Die 3D-Abbildung ganzer Organe und die rechnergestützte Bildanalyse der Größe und Anzahl der Glomeruli trägt dazu bei, das Wissen über die Mechanismen verschiedener Nierenerkrankungen wie der diabetischen Nephropathie zu erweitern. Mit arivis Vision4D® auf ACQUIFER HIVE verarbeitet.

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von U. Roostalu, Gubra, Dänemark.}

Entwicklungsbiologie

3D-Datensatz einer P10-Maustrachea mit anatomischer Anordnung der mechanosensorischen Nervenfasern. Färbung: DAPI, Collagen IV (Alexa-488-Antikörper), sensorische Fasern (Reporterstamm mit tdTomato-Expression, Alexa-555-Antikörper), Neurofilamentprotein NF200 (myelinierte Nervenfasern, Alexa-647-Antikörper).
Die Probe wurde in PEGASOS geklärt (Jing et al, 2018, Cell Research) und in BB-PEG mit einem RI von 1,54 mit der Detektionsoptik 5×/0,16 foc. bzw. Clr 20×/1,0 nd = 1,53 abgebildet. Datensatz mit 5× Vergrößerung: Pixelskalierung 0,61 × 0,61×1,63 Mikron, 3 × 3 Kacheln, Zoom 1,5×, 1.230 z-Schnitte, Volumen 2,57 × 2,58 × 2 mm; Datensatz mit 20× Vergrößerung: Pixelskalierung 0,23 × 0,23 × 0,58 Mikron, 1 × 5 Kacheln, Zoom 1,0×, 4.206 z-Schnitte, Volumen 2,0 × 0,45 × 1,82 mm.

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von P.-L. Ruffault, C. Birchmeier, Laboratory of Developmental Biology/Signal Transduction; A. Sporbert, M. Richter, Advanced Light Microscopy; M.-Delbrück-Zentrum für Molekulare Medizin, Berlin.}

Extremitäten- und Rückenmarksregeneration bei Wirbeltieren

Salamander haben die bemerkenswerte Fähigkeit, ihre Extremitäten und das Rückenmark zu regenerieren. Mit molekulargenetischen Hilfsmitteln können nicht nur die Stammzellen identifiziert werden, die für diese komplexe Regeneration zuständig sind, sondern auch die als Verletzungsreaktion entstehenden Signale, die ihre Proliferation auslösen. Dieses Axolotl-Vorderbein wurde in Zimtsäureethylester geklärt (Masselink W. et al, Development 146, 2019) und mit der Detektionsoptik 5×/0,16 foc. und einem Brechungsindex von 1,57 abgebildet.
Der Multikachel-Datensatz wurde mit der ZEN-Bildgebungssoftware und der arivis Vision4D®-Software auf einer ACQUIFER HIVE-Datenplattform ausgerichtet, fusioniert und gerendert.

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von W. Masselink, Tanaka Lab, Research Institute of Molecular Pathology, IMP.
Bild mit freundlicher Genehmigung von P. Pasierbek, K. Aumayr, IMP BioOptics, Wien, Österreich.}

Neuromorphologie

Die Abbildung ganzer Zellen im menschlichen Gehirn ist angesichts der außerordentlich hochentwickelten Morphologie der Neuronen und ihrer Verteilung im gesamten Organ nahezu unmöglich. Organoiden ermöglichen in gewissem Maße ein besseres Verständnis des Gehirns, u. a. wie Neuronen in neuronalen Stammzellenkulturen entstehen. Mithilfe des ECi-Clearing lässt sich die Neuromorphologie von der lokalen bis zur globalen Ebene untersuchen, was faszinierende Möglichkeiten für die Untersuchung der Neuronmorphologie in 3D eröffnet.
35 Tage alte neuronale Organoide, mit GFP/tdTomato markiert (3 % GFP und 3 % tdTomato) und mit Objektiv Clr 20×/1,0 nd = 1,53 abgebildet.
Pixelskalierung: 222 × 222 × 567 nm.
Bildvolumen: 1,66 × 0,66 × 1,6 mm.

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von D. Reumann und J. Knoblich, IMBA, Wien, Österreich.}

Immunologie

Die Abbildung intakter Lymphorgane in 3D ermöglicht die Analyse und Quantifizierung der Immunantwort auf Virusinfektionen. T-Zellen wurden in Wildtyp-Wirtsmäuse transferiert. Der Lymphknoten wurde mit Ce3D (Li et al, PNAS 163, 2017) gereinigt, fixiert und geklärt und dann mit RI = 1,49 (ph 7) mit der Detektionsoptik 5×/0,16 abgebildet (Volumen 2,5 × 2,5 × 1,6 mm). Das Bild zeigt GFP-markierte native CD8+-T-Zellen (gelb), mit B220 (cyan) eingefärbte B-Zellfollikel sowie die CD31-Vaskulatur (magenta).

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australien.}

Abbildung der Vaskulatur eines ganzen Mausgehirns

Eine C57/BL6J-Maus wurde mit PBS und 4 % PFA perfundiert. Das Gehirn wurde mit Cell-Tracker™ CM-DiI-Farbstoff perfundiert und eingefärbt; dieser flüssige Farbstoff markiert die Vaskulaturmembranen. Die Probe wurde nach dem iDISCO+-Protokoll geklärt und in Zimtsäureethylester als letzter RIMS äquilibriert. Anschließend wurde die Probe in Zimtsäureethylester mit RI = 1,565 mit der Detektionsoptik Fluar 2,5×/0,12 in einer Transluzenz-Mesoskala-Bildgebungskammer abgebildet.

Das hochauflösende Einsatzbild rechts wurde mit Clr Plan-Neofluar 20×/1,0 Korr. nd = 1,53 erfasst.
Das Bildvolumen beträgt 13,1 × 13,1 × 6 mm bei einer Pixelauflösung von 1,83 × 1,83 × 6,77 μm. Die Erfassung erfolgte in etwa 40 Minuten in 4 × 4 Kacheln mit 866 z-Schnitten.
Das Datenvolumen liegt bei 93 GB. Die Daten wurden mit der ZEN-Bildgebungssoftware und mit arivis Vision4D® auf einer ACQUIFER HIVE-Datenplattform verarbeitet.

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von E. Diel, D. Richardson, Harvard University, Cambridge, USA.}

Abbildung der Interneuronen und Purkinje-Zellen eines ganzen Mausgehirns

Ein PV-tdTomato-Mausgehirn wurde nach dem CLARITY-Protokoll geklärt, die endgültige Bildgebung erfolgte in EasyIndex mit einem Brechungsindex von RI = 1,46.
Parvalbumin-Cre-erzeugende Expression von tdTomato – Parvalbumin wird in einer Population von Interneuronen im gesamten Gehirn sowie in Purkinje-Zellen im Kleinhirn exprimiert. Der Datensatz für das gesamte Gehirn wurde mit einem ZEISS Lightsheet 7 mit der Detektionsoptik 5×/0,16 foc. erfasst. Das Bildvolumen beträgt 11 × 20 × 8,8 mm bei einer Pixelauflösung von 0,91 × 0,91 × 5,35 μm (12.028 × 22.149 × 1.621 Voxel). Die Erfassung erfolgte in 6 × 10-Kacheln mit 1.621 z-Schnitten. Das Datenvolumen liegt bei 1,2 TB (805 GB nach Stitching). Die Daten wurden mit der ZEN-Bildgebungssoftware und mit arivis Vision4D® auf einer ACQUIFER HIVE-Datenplattform verarbeitet.

^{Probe mit freundlicher Genehmigung von E. Diel, D. Richardson, Harvard University, Cambridge, USA.}