ZEISS Correlative Cryo Workflow

Ihre Lösung für die TEM-Lamellenpräparation und die volumetrische Bildgebung unter Tieftemperatur-Bedingungen

Mit der Kryomikroskopie lassen sich Zellstrukturen im naturnahen Zustand untersuchen: Die Ultrastruktur der Zellen und Gewebe können frei von Artefakten konserviert werden und die Zellprozesse werden unmittelbar gestoppt. Die Kryomikroskopie stellt die Anwender allerdings vor komplexe Herausforderungen, wie zeitaufwändige Präparations- und Bildgebungsverfahren, Devitrifizierung, Eiskontamination oder Probenverlust – umso mehr, wenn die erfassten Daten über Bildgebungsmodalitäten hinweg korreliert werden sollen.

Der ZEISS Correlative Cryo Workflow verbindet Weitfeld-, Laser-Scanning- und FIB-SEM-Mikroskopie in einem einzigen nahtlosen, anwenderfreundlichen Arbeitsablauf. Die Hardware und Software in der Lösung ist für die Anforderungen korrelativer kryogener Workflows optimiert, von der Lokalisierung fluoreszierender Makromoleküle über die kontrastreiche Abbildung von Volumendaten bis zur Lamellenverdünnung direkt auf dem Grid für die Kryo-Elektronentomographie.

Zubehör für den korrelativen Kryo-Workflow

Bildgebung des naturnahen Zustands

  • Nahtloser Kryo-Workflow über mehrere Modalitäten
  • Schutz der Proben vor Devitrifizierung und Eiskontamination
  • Hochauflösende Fluoreszenzbildgebung
  • Kontrastreiche Abbildung von Volumendaten und 3D-Rekonstruktion
  • Gezielte Lamellenverdünnung auf dem Grid für Kryo-TEM-Anwendungen
  • Mehrzwecknutzung für Tieftemperatur- und Raumtemperatur-Anwendungen

Vereinfachter Workflow – Sie konzentrieren sich voll auf Ihre Forschung

Mit dem ZEISS Correlative Cryo Workflow meistern Sie die anspruchsvolle Kombination verschiedener Bildgebungsmodalitäten unter Tieftemperatur-Bedingungen. Die Workflow-Lösung vereint die Licht- und die Elektronenmikroskopie und ermöglicht so die volumetrische Bildgebung und die effiziente Präparation von TEM-Lamellen. Spezielles Zubehör vereinfacht den Arbeitsablauf und gewährleistet einen sicheren Transfer der Kryoproben zwischen den Mikroskopen. Die Software ZEN Connect stellt das Datenmanagement sicher und hält die Daten über den gesamten Workflow im Kontext. Eine Reihe von Verarbeitungswerkzeugen hilft, die Bildresultate zu verbessern.

Correlative Cryo Workflow im Labor
Doppelt markierte Hefezellen (CNM67-tdTomato und NUP-GFP).
Doppelt markierte Hefezellen (CNM67-tdTomato und NUP-GFP). LSM-Bild (links) und Crossbeam-Bild (rechts). Probe mit freundlicher Genehmigung von M. Pilhofer, ETH Zürich, Schweiz

Überragende Komponenten für höchste Datenqualität ihrer Klasse

Dank kryokompatibler Objektive und der hohen Empfindlichkeit des Airyscan-Detektors ermöglichen ZEISS LSM-Systeme das Lokalisieren von Proteinen und zellulären Strukturen mit hoher Auflösung, während eine schonende Beleuchtung und konstant niedrige Temperaturen die Proben vor Devitrifizierung schützt. Das ZEISS Crossbeam FIB-SEM bietet eine kontrastreiche volumetrische Bildgebung – auch ohne zusätzliche Kontrastierung der Proben mit Schwermetallen. Beide Modalitäten liefern wertvolle funktionelle und strukturelle Informationen für ein umfassendes Verständnis der Ultrastruktur, unabhängig davon, ob Sie die Erkenntnisse mit TEM-Studien vertiefen oder nicht.

Mehrzwecklösungen für die größtmögliche Produktivität Ihrer Imaging-Einrichtung

Im Gegensatz zu anderen Lösungen können die am Workflow beteiligten ZEISS Mikroskope nicht nur für die Kryomikroskopie, sondern auch für Anwendungen bei Raumtemperatur verwendet werden. Dieser Faktor ist insbesondere dann entscheidend, wenn die Mikroskope mit den Tieftemperatur-Untersuchungen nicht vollständig ausgelastet sind. Das Umrüsten der Geräte von Tieftemperatur- auf Raumtemperaturnutzung ist schnell erledigt und erfordert kein technisches Know-how. Diese Flexibilität gibt den Anwendern mehr Zeit für ihre Experimente. Imaging-Einrichtungen profitieren von einer besseren Auslastung und einer schnelleren Rentabilität ihrer Investition.

Core-Imaging-Einrichtung mit Kryoausstattung

ZEISS Correlative Cryo Workflow auf einen Blick

Korrelativer Kryo-Workflow

Vorteile

Bewertung der Probenqualität und Vorbeugung von Beschädigungen der Proben

Probenverlust, Eiskontamination und Devitrifizierung sind verbreitete Probleme der Kryomikroskopie. Der ZEISS Correlative Cryo Workflow trägt dazu bei, Ihre wertvollen vitrifizierten Proben vor vielen denkbaren Fallstricken zu schützen, die in diesem anspruchsvollen Workflow auftreten können.

Das ZEISS Kryo-Zubehörset verringert gemeinsam mit den Bildgebungsfunktionen des ZEISS LSM/Airyscan und ZEISS Crossbeam die Risiken eines Verlusts oder einer Zerstörung Ihrer Proben bei der Arbeit unter Tieftemperatur-Bedingungen.

Vor der Verarbeitung der Probe im Workflow steht die Vitrifizierung als ganz eigene Herausforderung. Trotz der jüngsten Entwicklungen in der Vitrifizierungstechnologie sind Proben oft immer noch mit einer dicken Eisschicht bedeckt oder sie sind nur teilweise vitrifiziert und zeigen Bereiche mit nichtamorphem Eis. Eine mangelhafte Vitrifizierung zerstört die Ultrastruktur der Zellen und Gewebe. Diese Bereiche können nur mit einem TEM erkannt werden, falls Ihr Lichtmikroskop oder das FIB-SEM keine Möglichkeit einer frühzeitigen Probenbewertung im Workflow bietet.

ZEISS LSMs eröffnen diese Bewertung anhand von verschiedenen Kontrastmethoden. Der herausragende Kontrast des ZEISS Crossbeam ermöglicht ebenfalls eine zuverlässige Bewertung der Probenqualität. So sparen Sie Zeit und die Effizienz der Untersuchungen steigt.

HPF-Träger mit vitrifizierten Proben
HPF-Träger mit vitrifizierten Proben (für weitere Details klicken)
TEM-Grids mit vitrifizierten Proben.
TEM-Grids mit vitrifizierten Proben. (für weitere Details klicken)

Eisdickenmessung und effiziente ROI-Ausrichtung

Die Eisdickenmessung spielt eine wichtige Rolle für die Bewertung der Probenqualität und für die Lokalisierung der zu untersuchenden Zellen in der vitrifizierten Probe. Mithilfe des Lichtmikroskops können Sie die Probe mühelos validieren. Auflicht und Konfokal-Fluoreszenzbildgebung liefern erste Hinweise auf die Qualität und geben Ihnen die Möglichkeit, vielversprechende Zellen eindeutig zu lokalisieren.

Spinnennetzartige, unscharfe Muster des Fluoreszenzsignals deuten oft auf mangelhaftes Gefrieren hin. Tauchgefrorene Proben zeigen zudem uneinheitliche Gefrierqualität und Konservierung innerhalb der Probe. Die Informationen zur Eisdicke und Eisqualität bilden die Grundlage für die zeitsparende Vorauswahl der Zellen, bevor die Probe in den nächsten Schritt im korrelativen Kryo-Workflow gelangt.

Tauchgefrorene HeLa-Zellen (Markierung mit Histone-2-GFP) als Beispiel für den idealen Zustand zur weiteren Bildgebung. Die Eisschicht ist etwa 6,8 μm dick und bedeckt die vitrifizierten Zellen. Diese Zellen sind optimal für die weitere FIB-SEM-Analyse geeignet.

Lösungsübersicht

ZEISS Kryo-Zubehörset

Für den ZEISS Correlative Cryo Workflow können verschiedene Probenträger herangezogen werden. Von TEM-Grid über AutoGrid und Saphirscheiben bis hin zu HPF-Planchetten: Mit dem Kryo-Zubehörset können Sie die Proben mühelos einlegen, transferieren und aufbewahren. Eine Auswahl an Material und Werkzeugen unterstützt die sichere Probenhandhabung im gesamten Workflow. Die Komponenten sind kompatibel zu:

  • Linkam CMS196V³ (Objekttisch für die korrelative Kryomikroskopie)
  • Quorum PP3010Z (Kryosystem)
ZEISS Kryo-Zubehörset
ZEISS Kryo-Zubehörset

Einfacher Probentransfer und sichere Probenhandhabung in ZEISS Crossbeam

Der ZEISS Correlative Cryo Workflow umfasst das hochautomatisierte, anwenderfreundliche gasgekühlte Kryopräparationssystem Quorum PP3010Z.

  • Die Kryopräparationskammer mit Turbomolekularpumpe bietet Werkzeuge für die kontrollierte, automatische Sublimation und die Sputter-Beschichtung.
  • Aus der Kryopräparationskammer, die direkt mit der ZEISS Crossbeam Kammer verbunden ist, wird die vitrifizierte Probe zur Bildgebung und zum Fräsen auf einen hochstabilen Kaltobjekttisch transferiert.
  • Die Kühlfallen in der Kryopräparationskammer und der Crossbeam-Kammer schützen die Probe vor Eiskontamination.
  • Das an der Säule befindliche Kühlsystem CHE3010 sorgt für die fortlaufende Kühlung über mindestens 24 Stunden.
  • Alle Quorum-Kryokomponenten werden über die Prepdek®-Arbeitsstation gesteuert, auch das Vakuum-Aufbewahrungsröhrchen für die Kryotransfervorrichtung und der TEM-Präparationsschrapper für die ZEISS Ladestation.
ZEISS Crossbeam: Drehbarer Kryo-Substage
ZEISS Crossbeam: Drehbarer Kryo-Substage

Die zuverlässigsten Bildgebungsmodalitäten in Kombination

Konfokal- und Weitfeld-Kryomikroskopie

Konfokal- und Weitfeld-Kryomikroskopie:
ZEISS Axio Imager / ZEISS LSM 900/980 mit Airyscan 2
ZEISS Axio Imager, das Lichtmikroskop der Wahl für den ZEISS Correlative Cryo Workflow, kann mit dem Kryoobjekttisch CMS196V3 von Linkam bestückt werden. Je nach Ihren Anforderungen können Sie den Axio Imager wie folgt konfigurieren:

  • als Weitfeldsystem (mit Apotome 3 für die Erfassung von 3D-Datensätzen)
  • als LSM 900/980 mit Airyscan 2 für die hochauflösende Konfokalbildgebung

Das besondere Design der Hardware soll die Devitrifizierung und Eiskontamination während der Bildaufnahme verhindern. Die Objektive im Bereich von 5× bis 100× unterstützen die Bildgebung von einem ersten Überblick in niedriger Auflösung bis hin zu Aufnahmen in hoher Auflösung. Verschiedene Belichtungsmethoden wie der Auflicht- oder der Durchlichtmodus unterstützen die Untersuchung der Probe aus verschiedenen Blickwinkeln und liefern so zusätzliche Informationen zur Eisdicke und Probenqualität. Der empfindliche Airyscan-Detektors, der eine äußerst sanfte Beleuchtung erzeugt, macht die Tieftemperatur-Bildgebung in hoher Auflösung möglich.

Sowohl das LSM als auch das Weitfeldmikroskop sind als Mehrzweckinstrumente ausgelegt und lassen sich schnell und einfach von Tieftemperatur- auf Raumtemperatur-Untersuchungen und umgekehrt umrüsten, und das ohne Einbußen bei der Bildqualität.

Volumetrische SEM-Bildgebung und TEM-Lamellenpräparation bei Tieftemperatur

Volumetrische SEM-Bildgebung und TEM-Lamellenpräparation:
ZEISS Crossbeam 350/550/550L
Die FIB-SEM-Technologie ist in verschiedenen Fachbereichen weit verbreitet und hat sich mittlerweile auch in den Biowissenschaften etabliert, zum einen als Werkzeug für das hochpräzise Schneiden biologischer Proben und zum anderen wegen ihrer Bildgebungsfunktionen, die sich ideal dazu eignen, die Ultrastruktur sichtbar werden zu lassen.

Der ZEISS Crossbeam ist ganz auf höchste Funktionsfähigkeit und höchsten Bildkontrast ausgerichtet. Selbst mit ungefärbten vitrifizierten Proben liefert dieses FIB-SEM kontrastreiche Bilder bei Tieftemperaturen, sodass Sie die Ultrastruktur der Zellen und Gewebe untersuchen können und die Zellkompartimente deutlich sichtbar werden.

Die niedrige Beschleunigungsspannung, die für die SEM-Kryobildgebung erforderlich ist, geht in der Regel mit teils erheblichen Abstrichen beim Kontrast einher. Der ZEISS Crossbeam erzeugt selbst bei niedrigen Beschleunigungsspannungen einen hohen Kontrast – das Resultat der einzigartigen Interaktion zwischen der Gemini-Elektronenoptik und den Detektoren. Diese Konfiguration eröffnet zudem die Möglichkeit, das Bildgebungs- und Fräsverfahren in Echtzeit zu beobachten: Sie können den Fräsvorgang präzise steuern und die gezielte Verdünnung ultradünner TEM-Lamellen auf dem Grid durchführen.

Der ZEISS Crossbeam lässt sich als Mehrzweckinstrument ohne Leistungseinbußen einsetzen.

Die zentrale Schaltstelle: Ein wohlausgewogenes Software-Paket

Die Software-Plattformen wurden um kryospezifische Funktionen erweitert, die den korrelativen Kryo-Workflow optimieren und die nahtlose Zusammenarbeit der verschiedenen Komponenten gewährleisten. Für die Herausforderungen, die sich aus der korrelativen Kryomikroskopie ergeben, wurden zusätzliche Software-Module entwickelt.

  • ZEISS ZEN
  • ZEISS ZEN Connect
  • ZEN EM Processing Toolbox
  • SmartSEM und SmartFIB
  • Cryo Drift Reduction
Korrelativer Kryodatensatz in ZEISS ZEN Connect
Korrelativer Kryodatensatz in ZEISS ZEN Connect

Anwendungen

ZEISS Correlative Cryo Workflow in der Anwendung

Zellbiologie: Erkennung seltener Ereignisse

Spindelpolkörperchen in Hefezellen lassen sich nur schwer lokalisieren. Diese Strukturen sind klein und selten. Mit dem ZEISS Correlative Cryo Workflow können Sie diese Zellstrukturen im naturnahen Zustand erkennen. Das LSM mit dem Airyscan-Detektor vereinfacht die Erkennung dieser Strukturen noch weiter, sodass zusätzliche Details abgebildet werden können. Alle Bilder – von einem ersten Überblick über die gesamte Zelle bis hin zu hochauflösenden Bildern dieser winzigen Strukturen – werden in einem ZEN Connect-Projekt geordnet, das alle erforderlichen Daten zur Relokalisierung dieser Zellstrukturen im FIB-SEM aufnimmt.

Mit dem Crossbeam können TEM-Lamellen der erkannten Bereiche für die Kryo-Elektronentomographie präpariert werden. Auch die volumetrische Bildgebung ist möglich. Die Workflow-Lösung bietet zudem eine Funktion, mit der Sie nach der Bildaufnahme alle Daten wieder miteinander in Verbindung bringen können. Die Crossbeam-Bilder oder die TEM-Tomogramme lassen sich mit den LSM-Daten zusammenführen und im dreidimensionalen Kontext rendern.

Mit NUP-(Kernporenkomplex)-GFP und CNM67-tdTomato markierte Hefezellen.
Probe und Tomogramm mit freundlicher Genehmigung von M. Pilhofer, ETH Zürich, Schweiz

LM- und EM-Datensatz – vom Grid-Überblick bis hin zur erkannten ROI für die weitere TEM-Tomographie
FIB-Bild der präparierten Lamelle; Lamellendicke: 230 nm
FIB-Bild der präparierten Lamelle; Lamellendicke: 230 nm
Segmentiertes und rekonstruiertes Tomogramm

Zellbiologie: Korrelative volumetrische 3D-Bildgebung

Sobald Zellstrukturen wie Spindelpolkörperchen mit dem LSM-System erkannt wurden, kann die Ultrastruktur dank der überragenden Bildgebungsqualität des ZEISS Crossbeam gezielt per volumetrischer Kryobildgebung abgebildet und analysiert werden. Der Crossbeam liefert selbst bei niedriger Beschleunigungsspannung kontrastreiche Aufnahmen ungefärbter vitrifizierter Proben und schützt gleichzeitig die Proben vor Beschädigung. Die hochauflösenden Bilder des LSM und die kontrastreichen Bilder des Crossbeam erleichtern die präzise Bildüberlagerung. Nach der Relokalisierung der ROI im Crossbeam mit ZEN Connect wurden 3D-Datensätze der erkannten Zellen aufgenommen. Es wurde auf zwei Spindelpolkörperchen im korrelativen Volumen abgezielt. Die Ausrichtung der einzelnen Mikrotubuli wird in den kontrastreichen Bildern gemäß der Schneidrichtung des FIB deutlich sichtbar. Im 3D-Volumen konnten weitere Zellkompartimente erkannt werden.

Probe mit freundlicher Genehmigung von M. Pilhofer, ETH Zürich, Schweiz

Überlagerung eines hochauflösenden LSM-/Airyscan-Bilds mit einem kontrastreichen Crossbeam-Bild nach Aufnahme unter Tieftemperatur-Bedingungen. Die Überlagerung wurde mit ZEN Connect vorgenommen.
3D-Volumenrekonstruktion von Hefezellen und Segmentierung des Zellkerns (dunkelblau) sowie verschiedene Mitochondrien.
Axial geschnittenes Spindelpolkörperchen
Axial geschnittenes Spindelpolkörperchen innerhalb der Zellkernmembran (oben) und Querschnitt der Mikrotubuli außerhalb der Zellkernmembran (unten). Bildschrittweite des aufgenommenen Stapels: 50 nm

Krebsforschung

Krebszellen zeigen einen starken Phänotyp gegen die mitochondriale Teilung, der potenziell ihre Arzneimittelresistenz erläutert. Chemische Fixationsmethoden erzeugen häufig Artefakte, beispielsweise eine Ablagerung von Mitochondrien, die als Teilungsereignisse fehlinterpretiert werden können. Die Kryofixation umgeht diese Artefakte und konserviert die Proben im naturnahen Zustand.

Das Beispiel zeigt Adenokarzinomzellen nach dem Tauchgefrieren auf Saphirscheiben. Die LSM-Daten zeigen bereits ein dichtes mitochondriales Netz mit erhöhter Teilung, das nachfolgend durch die Crossbeam-Daten bestätigt wird. Nach der Aufnahme mit LSM und Airyscan wurde die vitrifizierte Probe zum Crossbeam transferiert. ZEN Connect konnte die ROIs relokalisieren, wodurch der entsprechende Datensatz nach der Aufnahme überlagert und alle erfassten Bilder geordnet wurden.

Tauchgefrorene Adenokarzinomzellen auf Saphirscheiben.
Tauchgefrorene Adenokarzinomzellen auf Saphirscheiben. Alle ROIs werden in ZEN Connect im Kontext dargestellt.
3D-Datensatz einer einzelnen Adenokarzinomzelle mit Muster einer starken mitochondrialen Teilung.
3D-Datensatz einer einzelnen Adenokarzinomzelle mit Muster einer starken mitochondrialen Teilung.
Automatisch segmentiertes mitochondriales Netz in einem Subvolumen eines Crossbeam-Datensatzes.

Pflanzenwissenschaft

Die Reaktion von Pflanzen auf veränderte Umgebungsbedingungen (z. B. auf einen erhöhten Salzgehalt) ist ein wichtiges Forschungsthema in der Pflanzenwissenschaft. Pflanzen zeigen in der Regel Stressreaktionen, wenn sie veränderten Bedingungen ausgesetzt sind. Auf Ultrastrukturebene lässt sich unter anderem die Bildung sogenannter Stromuli beobachten, also schlauchartiger Verlängerungen der Plastide.

Das ZEN Connect-Projekt zeigt Bilder verschiedener Bildgebungsmodalitäten: Mit dem LSM wurden die Stomata und die internalisierten Plastide anhand der Autofluoreszenz der Probe lokalisiert. Nach der erfolgreichen Relokalisierung der ROI wurde das LSM-Bild mit einem SEM-Überblickbild des ausgewählten Stomas überlagert. Ein FIB-Bildstapel des Stomas wurde aufgenommen. Der EM-Datensatz zeigte eine erhöhte Stromulusbildung in den Plastiden.

Probe mit freundlicher Genehmigung von C. Burkhardt, NMI Reutlingen

Stomata und internalisierte Plastide wurden mit dem LSM anhand der Autofluoreszenz der Probe erkannt.
Stomata und internalisierte Plastide wurden mit dem LSM anhand der Autofluoreszenz der Probe erkannt. Das ausgewählte Stoma wurde relokalisiert und mit dem Crossbeam abgebildet.
Die Stromuli sind in den mit dem Crossbeam aufgenommenen Schnittebenen gut sichtbar.
Die Stromuli sind in den mit dem Crossbeam aufgenommenen Schnittebenen gut sichtbar.
Die 3D-Rekonstruktion und die Segmentierung des FIB-Bildstapels zeigt die Morphologie der Plastide. Die Rekonstruktion zeigt Stromuli in enger Interaktion mit Mitochondrien.

Entwicklungsbiologie: Untersuchung von mitotischen Zellen in C. elegans

Ganze Würmer der Art C. elegans wurden mit HPF fixiert und embryonale Zellen in der Metaphase wurden in situ mit der Kryofluoreszenzmikroskopie abgebildet. Anschließend wurden die untersuchten Würmer per Gefrieraustausch mit Schwermetall gefärbt, in Harz eingebettet und geschnitten, sodass dasselbe Volumen mit hoher Auflösung und hohem Kontrast durch den Crossbeam lokalisiert und dargestellt werden konnte. Mit diesem Workflow konnte die gewünschte Metaphase erfolgreich rekonstruiert werden. Dieser Ansatz führte zudem zu einigen Zufallsentdeckungen: Ein nahegelegenes interessantes punktförmiges Fluoreszenzsignal konnte mit einem mutmaßlichen Autophagosom korreliert werden.

Die Kryofluoreszenzmikroskopie von hochdruckgefrorenen dicken Proben kann somit transiente Zellstrukturen im naturnahen Zustand festhalten und abbilden. Durch die sachgemäße Verarbeitung und die anschließende korrelative volumetrische EM-Bildgebung können diese Zielarchitekturen dann in hoher Auflösung und in 3D rekonstruiert werden.

Mit freundlicher Genehmigung von Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH und Frederick National Laboratory for Cancer Research, USA

Oben: Der Wurm wurde bei Tieftemperatur mit einem LSM/Airyscan-System abgebildet, bevor der Gefrieraustausch erfolgte. Unten: Der eingebettete und gefärbte Wurm wurde mit einem Crossbeam dargestellt.
Oben: Der Wurm wurde bei Tieftemperatur mit einem LSM/Airyscan-System abgebildet, bevor der Gefrieraustausch erfolgte. Unten: Der eingebettete und gefärbte Wurm wurde mit einem Crossbeam dargestellt.
Rekonstruktion von Zellstrukturen wie einem Autophagosom (AP) oder dem Genom in verschiedenen mitotischen Phasen (*: Zelle in der Metaphase; #: Zelle in der Telophase).
Rekonstruktion von Zellstrukturen wie einem Autophagosom (AP) oder dem Genom in verschiedenen mitotischen Phasen (*: Zelle in der Metaphase; #: Zelle in der Telophase).
3D-Rekonstruktion von Zellstrukturen

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ZEISS Correlative Cryo Workflow

Your Solution for TEM Lamella Preparation and Volume Imaging under Cryogenic Conditions

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